赛多利斯：多平台联合阐释免疫细胞杀伤肿瘤细胞机制
利用患者自身免疫系统消灭癌细胞的免疫疗法为推进癌症治疗提供了巨大的希望。为了让身体抵御癌症，免疫细胞必须识别、接触、杀死并最终清除肿瘤细胞。例如，免疫检查点抑制剂（PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 通路抑制剂）和细胞毒作用诱导剂（CD3xCD19 和赫赛汀）可以防止癌细胞逃逸免疫系统（Wei et al, 2018）。通过设计和引入 CAR-T 细胞来识别和杀死肿瘤细胞同样提供了巨大的潜力，目前已有几种细胞疗法成功获批上市（Strati and Neelapu, 2019）。而充分了解效靶细胞的相互作用过程是识别、验证新靶点和细胞治疗方法的关键。
现在赛多利斯提供了一种基于 iQue 高通量流式分析系统和 Incucyte® 活细胞成像分析系统的联合工作平台与工作流程，用于全面评估免疫细胞体外实验。在这一流程中可同时利用流式分析获取表达谱和细胞健康标记产生关于细胞亚型、激活状态和生存能力的信息，以及用活细胞成像分析获取细胞相互作用和杀死肿瘤细胞的过程中的时间和空间信息。
-具体流程如下
将带有绿色荧光核标记的靶细胞以适当密度种于 96 孔板中。
加入免疫细胞活化剂（如 CD3/CD28 Dynabeads），按不同效靶比加入不同密度的免疫细胞（如 T 细胞或 PBMC），及细胞毒/凋亡红色荧光探针（如 Annexin V）。
Incucyte® 在所需时间点对细胞成像，同时以适当间隔收取微量上清用于高通量流式分析细胞因子（IFNγ 和 TNFα）。
完成杀伤实验后将细胞消化移入 96 孔 V 型底板，并用 T 细胞活化检测试剂盒标记 T 细胞活化标志蛋白。
通过 iQue 高通量流式分析系统对整板细胞进行亚群分析和评估。
细胞形态和空间接触变化
在活细胞成像结果中，与对照组相比可以显著观察到 CD3/CD28 Dynabeads 诱导培养体系中的 PBMC 细胞活化发生的形态学变化，提示了免疫细胞的激活。同时无论在非贴壁或贴壁共培养的肿瘤细胞体系中，均出现了明显的效靶细胞空间接触的增加。
量化效靶细胞数量
靶细胞数量的变化提示了免疫细胞诱导产生的细胞毒作用。Incucyte® 成像和 iQue 流式分析都可以提供可靠的靶细胞量化计数结果，并且具有高度的一致性，均显示活化的 PBMC 对肿瘤细胞诱导产生了显著的杀伤效应。
细胞因子浓度-效靶细胞计数动态分析
将由 iQue 量化的不同时间点的细胞因子浓度数据与对应时间点的 Incucyte® 图像表型数据关联起来，可为整个免疫杀伤实验动态过程提供了更深入的洞察力。
不同浓度 CD3 / CD28 Dynabeads 处理组的免疫细胞的细胞因子出现了不同水平的增加，且与 Dynabeads 呈现浓度依赖变化。IFNɣ 水平在实验开始 24 h 后大幅增加，96 h 后达到最大浓度。TNFα 浓度增速更快，但在 72 h 达到最大水平后开始下降。在 48~60 小时后，效应细胞的增殖水平与细胞因子浓度呈正相关。而效应细胞杀伤引起的靶细胞数量降低也起始于这一时间段，靶细胞数量降低水平直接与效应细胞活化水平正相关。
细胞亚群分析
在杀伤实验达到终点后，每孔细胞被收集用 iQue 高通量流式系统的 T 细胞活化试剂盒对 CD4 和 CD8 细胞上的早期活化（CD69）、中期活化（CD25）和晚期活化（HLA-DR）标志分析。CD69 和 CD25 需要单独激活 T 细胞受体（TCR），而 HLA-DR 需要额外的 CD28 或抗原提呈细胞的共刺激。在未活化的对照组中，亚群分析显示 CD8 阳性细胞中 CD69、CD25 或 HLA-DR 阳性细胞均为低水平。加入 CD3/CD28 Dynabeads 后则引起所有三个标志表达呈浓度依赖性升高。
总结
在这一联合应用中，通过 Incucyte® 自动动态图像分析功能获取形态学信息和对靶细胞计数，以及 iQue T 细胞激活和细胞因子分析试剂盒及 QBeads 用于细胞因子分析、细胞亚群分析。在本流程中，免疫细胞激活、肿瘤细胞死亡和细胞数量量化的形态学变化通过 Incucyte® 活细胞成像系统分析和阐明，而 iQue 高通量流式系统用于分析细胞因子释放信息和细胞亚群。重要的是，Incucyte® 平台上的实时数据分析可以为流式细胞分析的检测时间点选择提供了可靠的依据，联合应用平台使得两种技术的效用实现了最大化。
-仪器和试剂-
Incucyte® 活细胞分析系统
iQue3 高通量流式细胞仪
T 细胞活化和细胞因子分析试剂盒
Incucyte® NucLight 慢病毒绿色荧光试剂
Incucyte® Annexin V 红色荧光试剂
(责任编辑：金利仪器lyh)
